體外診斷試劑產(chǎn)品注冊技術(shù)審評報(bào)告

產(chǎn)品中文名 稱：腦炎/腦膜炎多重病原體核酸聯(lián)合檢測 試劑盒（封閉巢式多重 PCR 熔解曲線法） 

產(chǎn)品英文（原文）名稱：FilmArray? Meningitis/Encephalitis (ME) Panel 

產(chǎn)品管理類 別：第三類 

申 請 人 名 稱：拜奧法爾診斷有限責(zé)任公司 BioFire Diagnostics, LLC 

國家藥品監(jiān)督管理局

醫(yī)療器械審評中心

基本信息

 一、申請人名稱 

拜奧法爾診斷有限責(zé)任公司BioFire Diagnostics, LLC 

二、申請人住所 

515 Colorow Drive, Salt Lake City, Utah 84108, USA 

三、生產(chǎn)地址 

515 Colorow Drive, Salt Lake City, Utah 84108, USA

技術(shù)審評概述 

一、產(chǎn)品概述 

（一）產(chǎn)品主要組成成分 本試劑盒包含以下組分，主要組成成分見表 1。 

表 1 試劑盒主要組成成分

（二）產(chǎn)品預(yù)期用途 

本產(chǎn)品用于體外定性檢測具有腦膜炎及/或腦炎體征及/或癥 狀的人群的腦脊液 (CSF)樣本中的 14 種細(xì)菌、病毒和酵母菌的核 酸。包括：大腸埃希菌 K1 株、流感嗜血桿菌、單核細(xì)胞增生李 斯特菌、腦膜炎奈瑟菌（有莢膜）、無乳鏈球菌、肺炎鏈球菌； 巨細(xì)胞病毒、腸道病毒、單純皰疹病毒 1 型、單純皰疹病毒 2 型、 人皰疹病毒6 型、人雙?？刹《尽⑺?帶狀皰疹病毒；新型隱球 菌（新生/格特）

中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）感染是引發(fā)腦及/或腦周圍的腦膜組 織炎癥（即腦炎、腦膜腦炎；在此統(tǒng)稱為 ME）的原因。約有 15% 的感染具有致死性，而其他可能會(huì)導(dǎo)致終身殘疾，例如截肢、視 力和聽力缺陷、癲癇和學(xué)習(xí)/記憶功能異常。本產(chǎn)品可用于從腦 脊液（CSF）中檢測鑒定出 14 種潛在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染相關(guān)病原 體?？稍诖蠹s一小時(shí)左右通過本產(chǎn)品檢測獲得所測樣本的結(jié)果。 本產(chǎn)品是診斷腦膜炎及/或腦炎相關(guān)的病原體的一種輔助手 段，所得檢測結(jié)果應(yīng)結(jié)合其他臨床、流行病學(xué)和實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)使用。 檢測的結(jié)果不應(yīng)用作診斷、治療或其他患者處置決策的唯一依據(jù)。 陽性結(jié)果不能排除與產(chǎn)品未涵蓋的微生物存在共感染的情況。檢 測到的病原體不一定是疾病的明確病因。陰性結(jié)果并不能排除中 樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）感染。 

（三）產(chǎn)品包裝規(guī)格 

貨號（RFIT-ASY-0118）：30 測試/盒;

 貨號（RFIT-ASY-0119）：6 測試/盒。

（四）產(chǎn)品檢驗(yàn)原理 

本產(chǎn)品采用多重巢式 PCR 擴(kuò)增并結(jié)合熔解曲線分析，對通 過腰椎穿刺獲得的腦脊液樣本中的上述 14 種病原體核酸進(jìn)行檢 測。 

產(chǎn)品是一種一次性封閉檢測試劑，其中包含分離、擴(kuò)增和檢 測所需的所有成分。測試條的硬質(zhì)塑料組件內(nèi)裝有凍干試劑。測 試條的軟質(zhì)塑料部分含有多個(gè)囊泡，在其中進(jìn)行各個(gè)反應(yīng)步驟。 

產(chǎn)品結(jié)構(gòu)如下圖所示。

用戶將樣本加載到測試條中，隨后將測試條放入 FilmArray 系統(tǒng)，由儀器自動(dòng)進(jìn)行以下操作及檢測：

 1.核酸純化：核酸純化發(fā)生在測試條的前三個(gè)反應(yīng)區(qū)。樣本 通過瓷珠進(jìn)行機(jī)械研磨破碎，并配合相應(yīng)化學(xué)試劑通過磁珠技術(shù) 進(jìn)行樣本中核酸的捕獲、洗滌和洗脫釋放。

 2.逆轉(zhuǎn)錄和第 1 輪多重 PCR：測試條檢測的部分病原體屬于 RNA病毒，因此在擴(kuò)增前需運(yùn)行逆轉(zhuǎn)錄步驟將病毒RNA轉(zhuǎn)化為 cDNA。純化后的核酸溶液與預(yù)熱的預(yù)混試劑混合以啟動(dòng)逆轉(zhuǎn)錄 步驟和隨后的多重PCR反應(yīng)，第1階段PCR的反應(yīng)體系中包含數(shù)十 對引物，多個(gè)PCR反應(yīng)同時(shí)在一個(gè)反應(yīng)體系中進(jìn)行，用于富集樣 本中存在的病原體核酸片斷。

 3.第 2 輪巢氏 PCR：第 1 階段PCR反應(yīng)的產(chǎn)物經(jīng)稀釋后與含 有DNA結(jié)合染料的第二輪PCR試劑混合。將該混合溶液分配到第2階段PCR的102孔陣列當(dāng)中。該陣列的各個(gè)孔位中已包含用于不 同病原體檢測的引物（每種在不同的孔位中重復(fù)三次）和陽性質(zhì) 控模板材料，用于檢測各種待測病原體的特定核酸序列。第2階 段PCR反應(yīng)使用的巢式引物結(jié)合在第1階段多重PCR反應(yīng)特異性產(chǎn) 物內(nèi)部，提高了反應(yīng)的靈敏度和特異性。

4. DNA 熔解曲線分析：在第2階段PCR反應(yīng)之后，系統(tǒng)緩慢 升高溫度并監(jiān)測和分析第2階段PCR反應(yīng)陣列中每個(gè)孔的熒光來 生成熔解曲線。特定PCR產(chǎn)物解鏈時(shí)的溫度（熔解溫度或 Tm） 恒定且可預(yù)測，F(xiàn)ilmArray 軟件自動(dòng)評估每個(gè)檢測病原體在三個(gè) 重復(fù)孔中的數(shù)據(jù)來報(bào)告結(jié)果。

二、臨床前研究概述 

（一）主要原材料 

1.主要原材料的選擇 本產(chǎn)品的主要原材料包括：DNA 聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、 引物等。引物由申請人設(shè)計(jì)并生產(chǎn)，其他主要原材料均購自外部 供應(yīng)商。申請人選擇有資質(zhì)的供應(yīng)商提供的原料，通過功能性試 驗(yàn)，確定了原材料的適用性，制定了各主要原材料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并 經(jīng)檢驗(yàn)合格。 

2.企業(yè)參考品和質(zhì)控品設(shè)置情況 每個(gè)檢測試劑均包含兩個(gè)質(zhì)控品：RNA 過程質(zhì)控品和 PCR2 質(zhì)控，在每次檢測中隨樣本運(yùn)行。RNA 過程質(zhì)控品為真實(shí)樣本， 即純化的粟酒裂殖酵母。酵母菌為凍干形態(tài)，在裝載樣本后得以 溶解，并經(jīng)歷檢測過程的各個(gè)階段，包括裂解、核酸純化、逆轉(zhuǎn)錄、第 1 輪 PCR、稀釋、第 2 輪 PCR 和熔解曲線分析。陽性結(jié)果 表示測試條中的所有步驟均執(zhí)行成功。PCR2 質(zhì)控由一對退火的 互補(bǔ)寡核苷酸組成，在產(chǎn)品生產(chǎn)中與其他引物一起添加在陣列中， 參與 PCR2 擴(kuò)增反應(yīng)，用于確認(rèn) PCR2 擴(kuò)增步驟中陣列填充和熒 光檢測的正確性。 企業(yè)內(nèi)部參考品包括陽性參考品和陰性參考品。陽性質(zhì)控品 由涵蓋檢測范圍內(nèi)所有病原體不同亞型的混合物組成。陰性參考 品用于確保測試條未出現(xiàn)因污染或非特異性擴(kuò)增而引起的非預(yù)期 的陽性結(jié)果。

 （二）生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系研究

 申請人通過對試劑主要生產(chǎn)工藝如凍干工藝的研究，確定了 最佳生產(chǎn)工藝。申請人對反應(yīng)體系中樣本量、引物濃度、DNA 聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、離子的濃度以及逆轉(zhuǎn)錄的時(shí)間及溫 度、PCR1 和 PCR2 的退火延伸時(shí)間及溫度、循環(huán)數(shù)的選擇等進(jìn) 行優(yōu)化，并通過驗(yàn)證最終確定了最佳反應(yīng)體系。 

（三）分析性能評估

 本產(chǎn)品分析性能評估內(nèi)容包括最低檢出限、包容性、分析特 異性、精密度、干擾物質(zhì)和競爭性抑制等。申請人提交了有效運(yùn) 行 的 質(zhì) 量 體 系 下 生 產(chǎn) 的 三 批 產(chǎn) 品 在 適 用 機(jī) 型 FilmArray、 FilmArray 2.0 和 FilmArray Torch 上進(jìn)行了性能評估。

1.最低檢出限 

通過對含有已知濃度的一種至五個(gè)微生物（細(xì)菌、病毒和酵 母菌）的系列稀釋樣本進(jìn)行檢測，對本產(chǎn)品的檢出限進(jìn)行預(yù)估。 

通過對含有預(yù)估檢出限濃度分析物的樣本進(jìn)行 20 次重復(fù)檢測， 來確認(rèn)檢出限。如果在 20 次重復(fù)檢測中至少 19 次為陽性 (19/20=95%)，則可確認(rèn)檢出限。14 種病原體的檢出限數(shù)據(jù)如下。

     選擇能夠代表測試條包容性的 101 個(gè)分離株進(jìn)行檢測，所選 分離株能夠代表病原體相關(guān)的種屬、亞種或血清型，在接近檢出 限濃度的水平進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示測試條能正確檢出所有分離株。 同時(shí)對本產(chǎn)品可以檢測卻無法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測試的不常見的菌株或血 清型進(jìn)行了生物信息學(xué)分析以預(yù)測其反應(yīng)性，未觀察到任何漏檢 情形。